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                放射♀免疫法測定肉、牛奶和蛋中的氯黴素殘留量(EEC, 篩選法)

                點擊數: 【字體: 打印文章 雙擊鼠標滾動屏幕
                 


                RIA Screening Method for the Detecion of Chloramphenicol in Meat, Milk and Eggs (EEC, Sg3.3 Screening Method)

                安詳操縱留意事項及施舍
                嘗試中行使有機溶劑時按隱藏傷害品處理賞罰劃定操縱♂♂,並在透風櫥內一怔舉辦。
                弁言
                氯黴素(CAP)是具有廣譜性浸染的抗生素,作為獸藥用於家畜疾病的提防和治療。歐盟(EEC)在CVMP決策中劃定不應承在蛋雞和這是死神漩渦斬乳牛中行使。
                1 主題內容
                歐盟(EEC)對氯黴素擬定了全面限→定行使的劃定。為了確保農場主在蛋雞和乳牛中不再行使氯▂黴素,同時為了對動物源肉品中氯黴素的監控,因此從豢養場和屠宰場抽取的樣品舉辦 篩選檢測的目標,擬定了本法。一旦篩】選呈陽性,必需進一步檢討確證。
                2 應用範疇
                本法老柳瘋狂大吼用於肉、牛奶和蛋中氯黴素殘留量的判斷。要領檢這是神尊強者測限:牛奶和蛋,1 g/L或1 g/kg;肉10 g/kg.
                3 參考文獻
                Commission Decision 93/256/EEC,laying down the method for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action [OJ.NO.L.118,14.4.93 PP 64-74]
                ISO Standard 78/2-1982 layout for standards Part 2:Standard for chemical Analysis ISO Standard 5725(1986)
                Radioimmunoassay for the measurement of chloramphenicol residues in eggs, milk and meat.(1993)
                Bundesgesundheitsampt, Berlin
                Arnold, And, lst Draft of the summary report of EEC Collaborative study “chloramphenical Methods ”,July 1987-February 1988.
                Arnold D, Vom Berg D, Boertz, A. K, Mallik, U. and Somogyi, A.(1984), Radioimmunologische Bestimmung Von Chloramphenicol-Ruckstanden in Musculatur, Milch und Eiern, Archiv, Fur Lebensmittel Hygiene, 35, 121-148
                Prei B. A, Balizs, G07 Bensch-Girke Th, Gude, A, Boenke, A. and Kroker, R, (1993)Preparation of reference materials for chloramphenicol in muscle and milk-date on puality criteria,In Proc.Euroresidues ⅡConference, Veldhoven NL. Vol. 2.558-562
                4 界說
                氯黴素含『量是指按本法測得的肉、蛋和牛奶中氯黴素的量,以 g/L或 g/kg暗示。
                5 要領概要
                本要領◥包羅三個步調
                ──樣品用乙酸乙酯提取;
                ──提取物用液-液分派法凈化(對付牛奶樣品用固相(SPE)凈化法)
                ──用放射免疫法██(RIA)舉辦檢測和宣量。
                6 原料
                6.1 試劑
                留意:全部試劑均為說明純
                6.1.1 乙酸乙酯
                6.1.2 甲醇
                6.1.3 三氯甲烷
                6.1.4 正已烷
                6.1.5 乙腈
                6.1.6 異辛烷
                6.1.7 氯化鈉
                6.1.8 乙醇 (絕對擔保說明純)
                6.1.9 綿羊白卵白()
                6.1.10 磷酸氫二□鉀
                6.1.11 磷酸氫二鈉
                6.1.12 疊氮化鈉
                6.1.13 活性炭 Norit A pract
                6.1.14 葡聚糖,分子質量約莫70000道爾頓(Pharmacia 1702800)
                6.1.15 水相液配制的閃爍液(Beckmann 270453721A)
                6.1.16 氯黴素()
                [留意:放射性標誌的氯黴素(CAP)(6.1.17)和抗血清(6.1.18)可從BGA(Berlin)購得。
                6.1.17 放射性標誌的丙酰那他們進入黑蛇部落氯黴素,3-羥基-3-(4 -硝苯基)-2-(N /3H/丙酰基)-氨基丙烷1-醇,放射量,61 Ci/mmol (2.26TBq/mmol),TRQ5394,(由BGA特約合成)。所提供的產物為在乙醇中為14.47 ci/mL。貯存於-20℃下。
                6.1.18 氯黴素單抗血清(BGA)
                61.19 蒸餾水
                6.1.20 冰
                6.2 氯黴素尺∮度品
                6.2.1 尺度溶液;氯黴素標樣配於乙醇中,濃度10ug/ml貯於4℃,至少莫非是有人看上了我們五號和六號可不變6個月。
                6.2.2尺度事變溶液用磷酸緩沖液(6.3.1)稀釋,獲得濃度為10, 25, 50, 100, 125, 250, 500, 1250, 2500ng/mL。改溶液◣限定一周內行▓使.
                [留意:要領機能考查回收20個校正點]
                6.3 溶液
                6.3.1 磷酸鹽緩沖溶液,PH7.45。3.4g KH2PO4, 3.55g Na2HPO4和0.5g疊氮化鈉溶於950毫升水中。調理pH至7.45,再用水定容至1升.
                6.3.2 抗血清預稀釋液1/200 (W/W) ;含2.5 mg/mL羊單抗血清(6.1.18)的磷╳酸緩沖液,貯存於-20℃。
                假如抗血清為冷凍幹燥情勢(BGA提供)則按如下操縱實力沒有繼續提升:
                ──將管子離心,以免喪失
                ──加1mL水
                ──在4℃下振蕩留宿使其重組。
                6.3.3 抗血清事變√液 1/75000 (w/w);取部門抗血清預稀釋液(6.3.2),稀釋375倍,貯於+4℃。
                6.3.4 放射配太不公平了嗎體事變液,取部門放射性標誌的同素物(6.1.17)用磷酸鹽話緩沖液稀釋,獲得1.08納摩爾濃度的溶液,當用配制貯存於4℃,限定一周內行使。
                6.3.5 活性碳懸浮液:將3g活性炭,0.5克葡聚破糖和0.25克羊單抗血清消融於1升pH7.45磷酸鹽緩沖液(6.3.1)中,混勻.
                6.3.5 乙腈/4%氯化鈉(1/1, v/v);由等體積的乙腈與4%氯化鈉溶▽液配制。
                7. 儀器裝備
                7.1 加液器; 0-20 L, 0-1000 L, 0-5000 L
                7.2 具塞離心管:10-12mL l,15-20mL,(Schmidt, Germany )
                7.3 微量試管 (Eppendort 3812)
                7.4 其螺旋蓋樣品瓶 10-20mL (Beckmann)
                7.5 容量瓶 10mL和100mL
                7.6 自動加液器,(“Dispensette”,Brand Germany )
                7.8 快速真空裝置 (savant ,VSA)
                7.9 管子攪拌器 型號HEIDOLPH “TOP-mix”
                7.10 旋轉攪拌器 具有旋㊣轉板,型號HEIDOLPH“Reax 2”
                7.11 渦旋殽雜器
                7.12 透風櫥
                7.13 真空離心機( UneEquip,Germany)
                7.14 液體閃爍計數器(Beckmann)
                7.15 冷凍箱,約莫-18℃至-20℃
                7.16 冷藏室/冷凍室
                7.17 巴氏移液管
                7.18 試管 75mm×12mm
                7.19 闡△來日誥日平
                7.20 冷凍離心機 (sorvall, USA)
                7.21 臺式離心機
                7.22 C18小柱 (sep-par, C18, Waters-Millipore, Cat No 519)
                8. 樣本和取樣進程
                註釋:留嘴角泛起一絲詭異意事項在ISO文件7812-1982和6.3.1節有所描寫。下面註釋源於2052/VI/84-EN中的附錄Ⅱ.
                8.1 樣⊙品天性狀:牛奶、肉和蛋樣品,應是被用來進性行殘留物檢劍無生測的樣品。
                8.2 樣品量:樣品量應能滿意要領的測定以及一再測按時所需的量。
                8.3 取樣後的樣品必∩需冷凍,貯存於-20℃以下。
                9. 檢測步調
                9.1 檢測樣品的制備。
                9.1.1 肉:取在0-4℃奇怪的肌肉組織樣品並剁碎,對付凍肉,解凍後剁碎,混勻。樣品待測前應在0-4℃中生涯,並在48小時內說明。如要貯存較長時刻,則應在-20℃以下冷凍或最虧得-80℃冷凍,擔保其☆不變。
                9.1.2 蛋:均質
                9.1.3 牛奶:質料奶或任何經均質但未變性的經加溫的氣勢堪比真神牛奶。
                9.2 肉和蛋的預提取處理賞罰
                9.2.1 將3g毀壞肉或均質蛋置於離心管中
                9.2.2 蛋樣:滴加5ml慚腈,攪拌。 肉樣:加8ml的乙腈/4%氯化◣鈉的溶液(6.3.6) 。
                9.2.3 充實殽雜成均質。
                9.2.4 4000g離心10min
                9.2.5 稱一股股龐大取並轉移至樣品瓶中。
                9.2.6 移取約1/6 (w/w)上清液至具蓋的玻璃離心管中
                9.2.7 加5m正已烷和2ml水並充實混和.
                9.2.8 1700g離心5min
                9.2.9 棄去上層
                9.2.10 一再9.27至9.29步調
                9.2.11 加3.5ml經乙酸乙酯飽√和並混勻的水
                9.2.12 1700g離心5min
                9.2.13 分取有機相,並將其蒸發至幹↘。
                9.3 牛奶的提取
                9.3.1 取1mL牛奶於玻璃試管中地步了,插手0.75mL三氯甲烷/異辛烷(3/2, v/v) 混勻.
                9.3.2 4000g離心15min
                9.3.3 取0.7mL上清液於C18小柱上。小柱預先按下列次序舉辦處理賞罰:
                5mL甲醇;5mL氯仿;5mL甲醇和10mL蒸餾水淋洗。
                9.3.4 樣品經10mL蒸餾水(9.1.19)淋洗
                9.3.5 加5mL乙腈/水(1/1, v/v)洗脫.
                9.3.6 加5mL水(經乙酸乙酯飽√和)抽提洗脫液中的氯黴素, 1700g離心
                9.3.7 移取上層液,用真空濃縮器濃縮至幹
                9.3.8 加0.7mL磷酸鹽緩沖液(6.3.1)消融殘●余物,按9.5.2步調操縱
                9.4 (原文無)
                9.5 放射免疫說明
                [留意:全部操縱步調●必需在0℃的冰浴中舉辦]
                9.5.1 用450mL磷酸鹽緩沖液(6.3.1)消融肉/蛋提取液(9.2.13)。肉的提取液用緩沖液稀釋約10倍,使氯黴素於緩沖液的濃度約莫為150pg/200mL。
                9.5.2 將下面溶ξ液歸並於玻璃試管中:
                ──200 L提取液(9.5.1或9.3.8)或尺度溶液(6.2.2)
                ──200 L放射配體事變液(6.3.4)
                ──400 L抗血清事變液(6.3.3)
                在最後插手抗血清後開始恒溫。
                [留意:每個♀樣品平行測定兩次]
                9.5.3 在+4℃中恒溫留宿
                9.5.4 在每個管內插手1mL經充實攪ξ 和的活性炭懸浮液必須在5分鐘內完成。
                9.5.5 在0℃中孵育30分鐘
                9.5.6 1700g 離心10min
                9.5.7 將上清液移入至足夠量的液閃液看著二六笑道中.
                9.5.8 在閃爍儀中,計數10分鐘或計數偏差在2%之內.
                10.0 功效計較
                10.1 要求校正曲線計較功效時回收『非線性措施是相宜的。
                [留意:在RIA中,進校正氯黴素標樣濃度和團力量之骨結量/總量(B/T)之間別離為非線性最小二次方曲線擬合中的自變量和因變量.若B/T值經對數↘轉換後,凡是只有校正曲線的中心部門呈線性。]
                對付樣品中氯黴素含量的▓計較,必要下列數據:
                A 每個試管中氯嗤黴素量(兩次均勻值),這些值是從校正曲線中測得的。
                F 校正因子,移入RIA管中的檢測樣》品鉆的比值。
                EA 從原提取樣液中取出用於凈化部門的樣隨時有部落會被別液重量。
                EW 原提取液重量。
                SW 樣品重量。
                蛋樣品
                F=22.5,對付說明含量中10ppb時
                EA=約為EW的←六分之一,回收準▅確數值
                EW=一樣平常為5-6.5克,回╱收準確數值
                SW=約為3克,回收準▅確數值
                肉樣品
                F=22.5,對付說我說過了明其含量濃度為10ppb時
                EA=約為EW的1/6,回收準確數值
                EW=一樣平常為7.5-9克,回收準確數值
                SW=約為3克,回收準確數值
                F=5,對付說明個中含量濃度為1ppb時
                EA=約為1,對付說明含♂量在1ppb時
                EW=約為1,對付說明含♂量在1ppb時
                SW=約為1,對付說明含量在1ppb時。
                功效計較式為:
                A F EW
                F = = ----------------------
                1000 EA SW
                10.2 慎密度
                在EEC用肉→和牛奶做協同試驗,測定功效如下:
                肉 牛奶
                現實含量( g/kg) 11.6 1.0
                測得均勻你是不是很想殺了我值( g/kg) 6.9 1.1
                一再性(ng/g) 3.2 0.72
                CV%(變異系數) 16 23
                重現性(ng/g) 7.0 1.1
                變異系數cv% 36 36
                嘗試室間cv% 32 28
                註1:這個數值未思量接納率的校正。
                本數據的說明憑證ISO尺度5725/1986舉辦。
                10.3 質量節制
                對下列每個說明工具必需』一再檢討兩次包羅:試劑空缺,動物組織空缺樣品,用作添加的青衣動物組織樣,也許的話尚有參考物質(標樣)。
                應測定移入每個說身上九彩光芒一閃明試管的總放射量。
                應測定非特異〓性團結放射配體的量,其值不能高出8%,

                #p#分頁問題#e#

                11 - 12 略
                13. 樣品格︽量節制
                肌肉,牛奶和蛋的基準物質由BGA制備並按DG12測定和試你說到底誰會死呢驗措施舉辦,最終彼此較量和認證。
                14 - 15 略
                16. 檢討流程圖
                肉/蛋----------------------------→溶劑提取
                牛奶---→溶劑提取---→C18 SPE小柱--→RIA----→測定功效


                 


                作者:admin 來源:網絡收集 發布時間:2016年05月22日