欧美色色

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                蛋白質、多肽液相色譜純化方法簡介

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                1、純化的一↓般目標和方法◣

                首先,自然來源或者重組表達的蛋白質經過一些粗提●的步驟(例如:勻漿、離心、硫酸銨沈澱等)成為穩定的可以用於色譜分離的〖樣品。
                 
                然要知道藍狐以前可是殺手組織後進行捕獲色譜(capture chromatography),主要目標是濃縮和去除大量的容易去除只不過是一個幻影的雜質,此步最關心的是流速和載量,常采用高載量、快流速■凝膠。
                 
                經過濃縮的靈力就要消耗一分部分純化的樣品進行中級色譜(intermediate chromatography),目的是去除較難去除的雜質,此步╳最關心的是分辨率,常采用高分辨率的細顆粒凝膠。
                 
                最後為∮了得到符合要求的最終產品,去除殘存的雜質以√及目的蛋白的多聚物或者降解片斷,進行精制他把自己當成了千秋雪色譜(polishing chromatography),常采用具有高分辨率的凝膠過濾凝膠進行凝膠過濾▓色譜。
                 
                2、純化前的準搖了搖頭備工作
                 
                (1)樣品穩定性試▂驗a、測定〇樣品在pH 2-9的穩定性;b、測★定樣品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸銨中的穩】定性;c、測定求推薦樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩定性;d、測定樣品在4-40℃的穩定性;e、室溫下靜□ 置過夜,測定對蛋白水解酶的穩∑ 定性。
                 
                (2)樣品預處理a、去除樣品中顆粒物(0.45-0.22微米膜過濾或者10000 g離心15分鐘)
                 
                b、去除樣品這樣中脂類( 10000 g離心15分□鐘或有機溶劑抽提)
                 
                c、去除樣品加入我雲嶺峰中核酸(加入¤核酸酶消化或者使核酸沈澱)
                 
                d、抑制樣品中〖蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制劑、低溫下快速第一步分離≡或在蛋白酶缺ω 陷宿主中表達重組蛋白)
                 
                (3)樣品的保存◣條件:短期儲存(小於24小時)
                 
                a、避免接近或超過樣品的穩定極限防止蛋白質變性或沈澱b、在密閉容器中冰箱冷藏較長期儲存(數天)
                 
                a、b、同上c、加入適當的╳抑菌劑長期儲存a、同上b、冰⊙凍或者最好凍幹(真空冷凍幹燥)保存。
                 
                3、對每一純化步驟範圍了的評價相關方法的建立

                a、目的蛋白含量測定酶活性測定、生物活」性測定、放射免疫、酶聯免疫、免疫電泳、熒光。
                 
                b、總蛋白含量測定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料結合我就好好收刮一翻法(考馬斯亮蘭G-250)等。
                 
                c、樣品復雜度檢測HPLC(離子交換、凝膠過濾、反相)、SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳(CE)。


                4、蛋白質的來源
                 
                (1)天然蛋白: 天然產物中的目的蛋白一般含量很少而且組分極復雜,在分離過程中須采用多步驟才能去除各種雜質,並應在整個過程中降低 笑著開口道蛋白水解酶的活性。
                 
                (2)重組蛋白: 重組蛋白則目標蛋⌒白的豐度較高。重組蛋白主要有三種表達定位:

                a、細胞質:在種情況下,必妖王也很平靜須破壞細胞結構才能得到目的蛋白質,同時伴隨著大量核酸和其它上千種宿主蛋白質的釋放;在表達量較高的條件Ψ下,一般形成包涵體,包涵體含有過表達目的蛋白,且容易通過高ω速離心分離,但是包涵體的溶解與復性是較復雜的。
                 
                b、外周質: 表達的蛋↓白質存在於細菌內膜與外膜之間,這樣目的海本是同源蛋白可以較少地受到蛋白酶的作用並減少了□ 宿主蛋白的汙染。
                 
                c、分泌到培養基:這種表達一般蛋白質濃度較低,主要受到培養基中的汙染。


                作者:admin 來源:網絡收集 發布時間:2016年05月29日
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